Das Gesamtgebiet des Biosphärenreservats ist als Landschaftsschutzgebiet ausgewiesen, in das 23 Naturschutzgebiete (NSG) und 10 Kernzonen eingebettet sind.
Kernzone (Schutzzone I)
Die Kernzone schützt die Teilbereiche des Spreewaldes, in denen weitgehend noch Natur pur zu finden ist. Sie nimmt 3 Prozent (1423 ha) des Biosphärenreservates Spreewald - in erster Linie naturnahe Waldbestände - ein. Hier werden die Ökosysteme ihrer natürlichen Dynamik überlassen, die Natur selbst bestimmt Entwicklungsrichtung, Werden und Vergehen. In den Kernzonen werden langfristige Umweltveränderungen beobachtet und erforscht. Die als Totalreservate bzw. Naturentwicklungsgebiete ausgewiesenen Naturschutzgebiete dürfen nur zu Forschungszwecken, aufgrund besonderer Rechte und von Behörden betreten werden.
Die Pflegezone (Schutzzone II)
Im inneren Bereich der Spreewaldniederung liegt die Pflegezone. Hier finden sich vor allem kleinflächige Feuchtwiesen, Niederungswälder, Niedermoore sowie die zahlreichen Fließe. Das Ziel ist hier, durch eine schonende Bewirtschaftung diese charakteristischen Lebensräume mit ihrer reichen Tier- und Pflanzenwelt zu bewahren. In enger Zusammenarbeit mit den Landnutzern werden dazu vielfältige Maßnahmen geplant und umgesetzt, um die Landschaft zu pflegen und zu entwickeln.
Die Flächen der Pflegezone sind als Naturschutzgebiet ausgewiesen. Auf ihren Wegen liegen wichtige touristische Routen - sowohl an Land als auch zu Wasser.
Entwicklungszone (Schutzzonen III und IV)
Die Entwicklungszone nimmt mit fast 80 Prozent den größten Teil des Biosphärenreservats ein. Sie enthält im Biosphärenreservat Spreewald einerseits Landschaftsbereiche, in denen eine nachhaltige Wirtschaftsweise das über Jahrhunderte gewachsene Landschaftsbild erhalten hat (Schutzzone III, Zone der harmonischen Kulturlandschaft). Durch eine Förderung der traditionellen Nutzungen und neue, modellhafte Ansätze nachhaltigen Wirtschaftens in allen Lebensbereichen wird hier eine ökologisch, wirtschaftlich, sozial, ethisch und kulturell nachhaltige Regionalentwicklung betrieben.
Teilbereiche der Entwicklungszone wurden in der Vergangenheit durch unsachgemäße, monostrukturierte Bewirtschaftung geschädigt. In der Biosphärenreservatsverordnung wurde sie als zusätzliche Untergliederung als Regenerationszone (Schutzzone IV) ausgewiesen, in der die Leistungsfähigkeit des Naturhaushaltes und die typische Lebensraumvielfalt der Kulturlandschaft des Spreewaldes erst schrittweise wiederhergestellt werden müssen. Im Spreewald wurde die gesamte Entwicklungszone zum Landschaftsschutzgebiet erklärt. Hauptziele von Landschaftsschutzgebieten (LSG) sind die Bewahrung des Landschaftsbildes und die Erhaltung bzw. Wiederherstellung der Leistungsfähigkeit des Naturhaushaltes.
LSG dienen vorrangig der Erholung, Land-, Forst-, Fischereiwirtschaft und Jagd sind im Rahmen der Schutzverordnung ohne wesentliche Einschränkungen möglich.